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限制性內(nèi)切酶: 使用前需要考慮的五件事

  • 發(fā)布日期:2019-10-24      瀏覽次數(shù):1550
    •    限制性內(nèi)切酶: 使用前需要考慮的五件事
        自20世紀(jì)70年代以來,使用限制酶來表征DNA的方法一直很受歡迎。如今,這種技術(shù)仍然是評估DNA序列簡單、快速的方法之一。與大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室試劑一樣,限制性內(nèi)切酶可能是變化無常的。無論你是簡單地消化一個(gè)質(zhì)粒,還是執(zhí)行復(fù)雜的克隆或篩選程序,都需要考慮幾個(gè)主要的因素:
        正確的使用條件
        每一種酶都是不同的,需要特定的條件,例如:
        BSA是許多限制性酶的穩(wěn)定劑;有些酶不能長時(shí)間工作超過1-2個(gè)小時(shí)
        大多數(shù)限制性酶在pH 7.2和pH 8.5之間有效地消化,使用合適的緩沖液很重要。
        大多數(shù)商業(yè)供應(yīng)商都有他們自己選擇和使用限制性內(nèi)切酶的特別指南,使用前應(yīng)了解清楚。
        在雙重限制性酶消化時(shí),如果兩種酶的佳條件不同,你可能需要部分地犧牲一種酶的活性。在分析結(jié)果時(shí)要考慮這一點(diǎn)。或者,可以進(jìn)行連續(xù)的消化,先使用種酶,凝膠提取去除緩沖液組分,然后用第二種酶消化。如果使用這種方法,開始用多個(gè)管子進(jìn)行相同反應(yīng)可能是明智的,因?yàn)樵谀z提取過程中,可能會(huì)丟失很多材料。
        甲基化作用
        當(dāng)細(xì)菌復(fù)制一個(gè)質(zhì)粒時(shí),它們通常將特定的CpG島甲基化。這些序列通常是甲基化的目標(biāo)。 限制性酶切位點(diǎn)也可能由于與甲基化位點(diǎn)有重疊而無法切割。此時(shí),限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)與旁側(cè)的序列恰巧組成Dam或者Dcm識別位點(diǎn),并進(jìn)而被甲基化而阻斷切割。因此在質(zhì)粒構(gòu)建設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)時(shí),要充分考慮到這種情況。
        在實(shí)驗(yàn)室大腸桿菌菌株中有三種不同類型的甲基化酶: Dam甲基化酶、Dcm甲基轉(zhuǎn)移酶和EcoKI甲基化酶。如果你想要消化一個(gè)可能被甲基化的限制位點(diǎn),你可以使用一個(gè)甲基化無能力的大腸桿菌菌株(JM11)來繁殖你的質(zhì)粒。這些大腸桿菌菌株無法甲基化DNA,從而你的限制性酶可以裂解CpG島。
        星活性小化
        一些限制酶在特定的條件下,它們可能會(huì)變得雜亂,隨機(jī)消化DNA,而不是在特定的識別位點(diǎn)。這種現(xiàn)象被稱為星活性,通常是由長時(shí)間的潛伏期或緩沖條件不佳(如pH)引起的。因此,使用所需的酶與推薦的緩沖液是至關(guān)重要的。
        此外,高甘油濃度可能會(huì)導(dǎo)致星活性增加。由于大多數(shù)酶和它們的緩沖液都被包裝成甘油來延長保質(zhì)期,所以你應(yīng)該充分稀釋緩沖液和酶。這也是為什么許多公司在他們的通用步驟建議20 - 50?l反應(yīng)體系和提供10 x緩沖液。
        給你的酶一些空間
        某些酶在識別位點(diǎn)兩邊有幾個(gè)堿基對時(shí)效率高。如果你要用雙切,兩種酶位置比較緊密,或者消化PCR產(chǎn)物的末端時(shí),這一點(diǎn)尤其重要。
        每個(gè)制造商對他們的產(chǎn)品都有具體的建議,但通常建議確保在識別位點(diǎn)的兩邊至少有6個(gè)堿基對。添加更多堿基對的簡單方法是通過PCR引物進(jìn)行設(shè)計(jì)。盡量避免帶有引物二聚體形成風(fēng)險(xiǎn)的序列。
        同裂酶和異裂酶
        有時(shí)你需要使用一種特殊的酶,它的條件并不適合你的實(shí)驗(yàn)設(shè)置。在這種情況下,同裂酶可能會(huì)幫助你進(jìn)行你的實(shí)驗(yàn),而不會(huì)嚴(yán)重影響你的終結(jié)果。
        同裂酶是兩種能識別相同的位點(diǎn),但具有不同性質(zhì)的限制性酶,通常來自不同的細(xì)菌體系。例如,SinI 和AvaII 都都識別序列G / G(A或T)CC。然而,AvaII是甲基化敏感的,而SinI不是。因此,如果你想要切斷這個(gè)序列,并且不想使用甲基化不敏感的大腸桿菌菌株,那么SinI可以滿足條件,而AvaII則不會(huì)。
        兩種酶具有相同的識別位點(diǎn),但在不同的堿基對上切割被稱為異裂酶。這可能有助于避免星活性和甲基化敏感性。例如, KpnI和Acc65I都識別這個(gè)位點(diǎn):GGTACC,但在不同的位置切割。KpnI切割bp 5:GGTAC / C,而Acc65I切割bp 1:G / GTACC。KpnI可能會(huì)顯示出星活性,而Acc65I則更強(qiáng)健。因此,如果切割位置不重要,Acc65I可能是一個(gè)更好的選擇。
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