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你對電泳是如何理解的

  • 發(fā)布日期:2020-05-26      瀏覽次數(shù):1408
    •   在凝膠電泳儀中,DNA或蛋白質(zhì)樣品的分離(通?;诖笮。┦峭ㄟ^施加電場使它們遷移通過凝膠來分離的。凝膠電泳在生物醫(yī)學(xué)研究實驗室中是常規(guī)操作,可用于回答各種不同的問題,因此,實際上并沒有一種通用的方法來分析結(jié)果。
        例如,諸如蛋白質(zhì)印跡,RNA印跡和DNA印跡的不同技術(shù)都涉及凝膠電泳。
        如果您要進(jìn)行DNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳(常見的一種方法),通常需要至少做兩件事:1)區(qū)分未切割的質(zhì)粒與插入片段,帶切口的質(zhì)粒和切割的質(zhì)粒,以及2)估計使用標(biāo)準(zhǔn)曲線Excel或計算器計算各種DNA片段的大小。
        運作方式如下。
        檢查您的實驗室筆記本以確定哪些樣品已裝入哪些通道。當(dāng)裝載凝膠孔時,您應(yīng)該注意每個泳道/樣品的身份。
        確定哪個泳道包含DNA標(biāo)準(zhǔn)的“階梯”。這些是已知長度的片段。它們的遷移距離可用于通過標(biāo)準(zhǔn)曲線Excel或其他計算器確定樣品片段的大小。
        用尺子測量從孔到跟蹤染料的圖像距離,該染料比任何DNA條帶都行進(jìn)的距離遠(yuǎn)(換句話說,它將位于凝膠的底部)。記錄此數(shù)字-您使用的單位并不重要。
        測量照片上從孔到“階梯”中每個帶的距離,然后用該距離除以跟蹤染料帶所經(jīng)過的距離。此計算為您提供每個頻段的相對遷移率。
        示例:假設(shè)跟蹤染料帶移動了6英寸,而我們有三個帶移動了5、4.5和3.5英寸。
        他們的相對流動性是什么?答:我們將5、4.5和3.5除以6得到的相對遷移率分別為0.833、0.75和0.5833。
        將相對遷移率輸入到電子表格程序(Excel或您使用的任何其他類似程序)中,并將階梯中每個片段的大?。ㄒ郧A基為單位)一起輸入。
        制造商會為您提供他們提供的梯子中每個碎片的大小,因此您應(yīng)該已經(jīng)有了此信息。
        在x上繪制具有相對移動性的數(shù)據(jù),在y上繪制以千為單位的大小的數(shù)據(jù)。
        在電子表格程序上使用趨勢線函數(shù)將方程擬合到數(shù)據(jù)中。該方程式應(yīng)為冪方程式(例如x ^ -2),并且應(yīng)相對較好地擬合數(shù)據(jù)(R系數(shù)至少為0.9)。這將創(chuàng)建一條曲線和一個標(biāo)準(zhǔn)曲線Excel。
        查看與您的樣本相對應(yīng)的譜帶。
        請記住,較小的DNA片段比較大的DNA片段穿過凝膠的距離更遠(yuǎn),因此靠近跟蹤染料的片段將小。但是請注意,如果未切割質(zhì)粒(環(huán)狀)DNA,它將像電話線一樣“超螺旋”或扭曲,這實際上會使它比相同大小的線性DNA 傳播得更遠(yuǎn)。
        同樣,未*切割的“切口”質(zhì)粒將比相同大小的線性DNA 傳播更短的距離。因此,您無法從凝膠中估計未切割質(zhì)粒的大小。
        將每個泳道中的條帶與您在該泳道中加載的樣品的標(biāo)識相匹配,并確定您所看到的是否是您所期望的。這將取決于實驗的性質(zhì)。
        但是,一般來說,如果您用兩種限制性酶消化插入質(zhì)粒,則可以預(yù)期該插入物中將沒有質(zhì)粒。
        由于它比質(zhì)粒小得多,您可能會在該泳道中看到兩條帶,一條靠近頂部,而另一條靠近底部。僅用一種限制酶切割的質(zhì)粒應(yīng)僅形成一條條帶,該條帶比用兩種限制酶切割的質(zhì)粒行進(jìn)的距離要遠(yuǎn)一些,但不能遠(yuǎn)至插入片段。
        測量從孔到切出的質(zhì)粒的距離,并用尺子插入條帶。將這些數(shù)字除以跟蹤染料的行進(jìn)距離,即可得出插入片段和切割質(zhì)粒的相對遷移率。
        將插入片段和剪切質(zhì)粒的相對遷移率插入電子表格程序為您計算的方程式中。這種計算應(yīng)給您估計這些質(zhì)粒的大小。
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